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RT-PCR技术服务

分类：实验中心
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发布时间：2021-04-28 16:58
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【概要描述】

RT-PCR技术服务

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反转录PCR（Reverse transcriptase PCR,RT-PCR）是一种从RNA扩增cDNA拷贝的方法。RT-PCR对于获得与克隆mRNA的5’、3’末端序列和从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库方面都是极为灵敏与通用的方法。此外，RT-PCR还易于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，还可用于测定基因表达的强度。我公司采用二步RT-PCR法，可满足客户不同的实验要求。
样品要求：提供的样品要新鲜并尽可能多，不推荐提供RNA样品，或者提供cDNA，并尽可能详细的提供背景资料（基因序列、Genebank accession number扩增产物的用途等）。

基本步骤
● 模板制备：见RNA提取技术服务。
● 引物设计
客户提供上、下游引物，或者我公司提供免费的引物设计及合成（包括RT-PCR半定量检测中的内参引物）。
● 反转录
（1）Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量<15 μl。

试剂名称	使用量
模板RNA	2μg
Oligo(dT)12-18 Primer（50μM）	2.5μl

（2）70℃保温5分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。
（3）离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。
（4）在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

试剂名称	使用量
上述模板RNA/引物变性溶液
5×M-MLV Buffer	5μl
dNTP Mixture（各10 mM）	1.25μl
RNase Inhibitor（40 U/μl ）	25U
M-MLV（200 U/μl ）	200U
RNase free dH₂O	up to 25μl

42℃保温1小时。
（5）70℃保温15分钟后冰上冷却，得到cDNA溶液。
若需要表达，参考基因表达服务。若需要进行RT-PCR半定量分析，接着以下的操作。
● RT-PCR半定量分析
PCR扩增目的基因及看家基因，产物经过琼脂糖凝胶电泳后进行灰度扫描分析。

提供结果
完整的实验操作步骤、电泳图、定量分析结果等。

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