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磷酸化蛋白富集试剂盒

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产品编号
BB-3108
数量
-
+
1
产品描述

 

注:
● 蛋白裂解液: 含多种有效成分,可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白,又可结合释出的蛋白
防止沉淀。
● 蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂混合物:包含AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、
Cantharidin、Microcystin LR、Bromotetramisole。
注意:
1、蛋白样品中不可含 EDTA。
2、蛋白酶抑制剂混合物避免反复冻融。
3、如果试剂盒不能短时间内用完,蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
4、每个柱的载量约为 1mg 磷酸化蛋白。
储存条件:
蛋白酶磷酸酶抑制剂-20℃保存;其它2-8℃保存。蛋白柱室温避光保存。
有效期:
一年。
注意事项:
● 本试剂盒仅供科学研究使用,不可用于诊断或治疗。
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖和管内壁上的液体离心至管底,避免开盖时试剂损失。
● 禁止与其他品牌的试剂混用,否则会影响使用效果。
● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿,可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。
产品简介:
我公司磷酸化蛋白富集试剂盒是利用磷酸基团与金属的亲和力,采用固定化金属螯合层析(IMAC)的方法富集磷酸化蛋白。可以选择性的对磷酸化蛋白和多肽进行富集和纯化。本试剂盒可以用来提取富集哺乳动物细胞、组织、细菌、酵母、植物等样本的的磷酸化蛋白。经本试剂盒制备的蛋白样品可用于Western blotting, mass spectrometry, 2D-PAGE和protein arrays 等下游应用。
试剂盒以外自备试剂和仪器
● 移液器、吸头 ● 离心机及离心管
● 涡旋振荡器 ● 冰箱,冰盒
使用方法:
使用注意事项:
1. 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
2. 实验过程中的所有试剂须预冷;所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
3. 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀,不影响使用,溶解后正常使用。
4. 蛋白样品中不可含 EDTA。
5. 上样蛋白样品 pH 值必须低于6,蛋白浓度在0.25-0.5mg/ml。
6. 洗涤细胞和组织是不能用 PBS 等磷酸盐缓冲液,要用非磷酸盐缓冲液,如50mM HEPES,Tris等或生理盐水。
7. 可以根据自己实验需要加入其它磷酸酶抑制剂单品。
8. 用蛋白柱进行磷酸化蛋白富集,需要离心操作时将蛋白柱置于一个 50ml 离心管离心即可。
9. 最终蛋白样品用于 2D 电泳前需脱盐。
一、蛋白样品的准备:
以下为由细胞和组织制备蛋白样品的参考步骤,其它方法得到的蛋白样品稀释至蛋白浓度为0.25-0.5mg/ml 后直接上样即可,确保蛋白样品的pH 值低于6。可以用试剂盒中的洗柱液、裂解液、洗涤液稀释蛋白样品。
细胞裂解:
1. 提取液制备:每 500ul 冷的裂解液中加入2ul 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
2. 取 5-10×106 个细胞,在4℃,1000rpm 条件下离心5-10 分钟,小心吸取培养基,尽可能吸干,收集细胞。
3. 用冷生理盐水洗涤细胞两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 每 5×106个细胞中加入500ul 冷的蛋白裂解液,混匀后,在4℃条件下振荡15-20分钟。
5. 在 4℃,14000rpm 条件下离心15 分钟。
6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到总蛋白裂解液。
组织裂解:
1. 提取液制备:每 500ul 冷的裂解液中加入2ul 蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物,混匀后置冰上备用。
2. 取 100mg 组织样本剪碎,加入总蛋白提取液,用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。
3. 将组织匀浆吸入一预冷的干净离心管中,在4℃,10000rpm 条件下离心5 分钟。
4. 将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到总蛋白裂解液。
植物蛋白提取:
1、裂解液制备:每500ul 冷的提取液中加入2ul 蛋白酶磷酸酶抑制剂,混匀后置冰上备用。
2、取 200mg 植物组织样本,去除粗筋脉络等后剪碎,置于研钵中用液氮研磨。(没有液氮也可直接置冰上研磨即可)
3、研磨后加入 500ul 提取液,混匀后于一个预冷的干净离心管中在冰上静置2-3小时。
4、在 4℃,12000rpm 以上条件下离心10-15 分钟。
5、将上清吸入另一预冷的干净离心管,即可得到总蛋白。
细菌蛋白提取:
注:细菌中磷酸化蛋白量较少,请根据样本情况调整所需的样本量。经过基因工程改造的可以直接合成表达磷酸化蛋白的细菌样本,根据情况处理细胞,不一定按下面的步骤。
1、裂解液制备:每500ul 冷的提取液中加入2ul 蛋白酶磷酸酶抑制剂,混匀后置冰上备用。
2、在 4℃ 12000RPM 条件下将菌液离心5min,弃上清,尽量吸干剩余液体,收集菌体,用生理盐水洗菌体2 次。若为冷冻菌体直接进行下面操作步骤即可。
3、按每 20mg 湿重菌体样本加入500ul 裂解液,吹打混匀,冰上放置20-30 分钟。
4、300w,10s 超声/10s 间隔条件下冰浴超声至菌液变清。
5、在 4℃ 12000RPM 条件下将菌液离心5 分钟,将上清移入冷的干净离心管。
6、即得到细菌总蛋白样品。
二、柱平衡:
加入 500ul 洗柱液洗柱,重力作用下或4℃下1000g 力离心1 分钟甩干吸附柱。
三、上样:
将以上蛋白裂解液或其它待富集蛋白样品加入吸附柱,重力作用下或4℃下1000g
力离心1 分钟甩干吸附柱。
四、洗柱:
加入 300ul 洗涤液洗柱,重力作用下或4℃下1000g 力离心1 分钟甩干吸附柱。重
复两次。
五、洗脱:
加入 500ul 磷酸化蛋白洗脱液,重力作用下或4℃下1000g 力离心1 分钟甩干吸附柱,收集洗脱液,即得到磷酸化蛋白。
六、柱保存和柱再生:
磷酸化蛋白纯化柱如果保存和处理得当的话可以多次重复使用。
使用后可以用 1ml 0.1M EDTA 溶液洗柱,然后在柱中加入20%乙醇溶液密封,置2-8℃保存。
加入 0.1M 氯化铁溶液,浸泡蛋白柱填料,即可对蛋白柱进行再生。
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