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RT-PCR技术服务

  • 分类:实验中心
  • 作者:
  • 来源:
  • 发布时间:2021-04-28 16:58
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【概要描述】

RT-PCR技术服务

【概要描述】

  • 分类:实验中心
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反转录PCRReverse transcriptase PCR,RT-PCR)是一种从RNA扩增cDNA拷贝的方法。RT-PCR对于获得与克隆mRNA5’3’末端序列和从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库方面都是极为灵敏与通用的方法。此外,RT-PCR还易于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性,还可用于测定基因表达的强度。我公司采用二步RT-PCR法,可满足客户不同的实验要求。
样品要求:提供的样品要新鲜并尽可能多,不推荐提供RNA样品,或者提供cDNA,并尽可能详细的提供背景资料(基因序列、Genebank accession number扩增产物的用途等)。

基本步骤
● 模板制备:见RNA提取技术服务。
● 引物设计
    客户提供上、下游引物,或者我公司提供免费的引物设计及合成(包括RT-PCR半定量检测中的内参引物)。
● 反转录
1Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液,全量<15 μl

 试剂名称

 使用量

 模板RNA

 2μg

 Oligo(dT)12-18 Primer50μM

 2.5μl

270保温5分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。 
3)离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。 
4)在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

 试剂名称

 使用量

 上述模板RNA/引物变性溶液

 

 5×M-MLV Buffer

 5μl

 dNTP Mixture(各10 mM

 1.25μl

 RNase Inhibitor40 U/μl 

 25U

 M-MLV200 U/μl 

 200U  

 RNase free dH2O

 up to 25μl

42保温1小时。 
570保温15分钟后冰上冷却,得到cDNA溶液。
若需要表达,参考基因表达服务。若需要进行RT-PCR半定量分析,接着以下的操作。
● RT-PCR半定量分析
PCR扩增目的基因及看家基因,产物经过琼脂糖凝胶电泳后进行灰度扫描分析。

提供结果
完整的实验操作步骤、电泳图、定量分析结果等。

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